品牌: wanleibio
公司: 沈陽萬類生物科技有限公司
貨號： WLA112b 保存條件： 4℃及-20℃ 規格： 50T
產品詳情請聯系金山科研平臺微信：jinshanbio 萬類生物試劑促銷：抗體5折，部分試劑盒8折！產品名稱：免疫共沉淀（Co-IP）試劑盒產品概述：免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP）是研究蛋白質間相互作用的一種常用方法,基本原理是以細胞內源性靶蛋白為誘餌，將靶蛋白抗體與細胞總蛋白進行共孵育，促進免疫復合物的形成；隨后加入能夠與抗體Fc段結合的prorein A beads，形成“結合蛋白-靶蛋白-靶蛋白抗體-protein A小珠”復合物，純化該復合物后凝膠電泳分離蛋白，應用Western blot或者質譜技術鑒定靶蛋白的結合蛋白。包裝信息：
試劑名稱WLA112a（20T）WLA112b（50T）保存條件裂解液20ml50ml-20℃Protein A beads2.4ml6ml4℃試劑 A4ml10ml室溫試劑B150μl300μl室溫蛋白標準品(5mg/ml BSA)50μl100μl-20℃
保存日期：本試劑盒自訂購之日起一年內有效。注意事項：1. 裂解細胞時，為防止蛋白降解，所有的操作盡量在冰上進行。2. 測定蛋白濃度時，樣品中若含有EDTA、EGTA、DTT、硫酸銨和脂類會影響檢測結果。3. 要確保抗體的特異性，即在不表達抗原的細胞溶解物中添加抗體后不會引起共沉淀，確保共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉淀得到的，而并非外源非特異蛋白，單克隆抗體的使用有助于避免污染的發生。4. Protein A beads離心時，離心力不易過高，會損壞Protein A beads，離心力在3000-5000×g即可。操作流程：1. 除去細胞培養基，用預冷的PBS（需自備）洗滌細胞兩次。2. 加入預冷的裂解液(見表1)，冰育5min。Wanleibio Co.,Ltd. 400-602-0407 sales@wanleibio.com www.wanleibio.com表1. 不同標準的細胞培養皿/板中裂解/洗滌緩沖液的建議添加量
培養皿/板的尺寸或表面積裂解/洗滌緩沖液體積100×100 mm500-1000 μl100×60 mm250-500 μl6- 孔板200-400 μl 每孔24- 孔板100-200 μl 每孔
3. 用預冷的細胞刮將細胞從培養皿或培養瓶上刮下，把懸液轉到1.5ml EP管中，緩慢晃動10min。4. 4℃，14000×g離心15min，將上清轉移至新的離心管中。5. 準備Protein A beads，用1ml PBS清洗三次（3000×g離心1min）后保存備用，此步驟可提前準備。6. 做蛋白標準曲線，測定蛋白濃度。① 配制工作液：根據標準品和樣品數量，按50體積試劑A加1體積試劑B(50：1)配制適量 工作液，充分混勻。② 稀釋標準品：取10μl標準品稀釋到100μl，使終濃度為0.5mg/ml。將標準品按0、1、2、4、 8、12、16、20μl加到96孔板的蛋白標準品孔中，再用PBS補足至20μl。③ 加適當體積樣品到96孔板的樣品孔中，再用PBS溶液補足至20μl。④ 向各孔加入200μl工作液，37℃放置30min(也可室溫放置2h)。⑤ 用酶標儀測定A562，根據標準曲線計算出蛋白濃度。7. 每1ml總蛋白中加入60μl Protein A beads，以去除非特異性雜蛋白，降低背景。8. 4℃，14000×g離心15min，將上清轉移到一個新的離心管中，去除Protein A beads。9. 用PBS將總蛋白稀釋到約1 μg/μl，如果目的蛋白在細胞中含量較低，則總蛋白濃度應該稍高（如10 μg/μl）。10. 加入2μg抗體到500μl總蛋白中，用搖床緩慢搖動抗原抗體混合物，4℃過夜。11. 加入60μl Protein A beads來捕捉抗原抗體復合物，室溫緩慢搖動抗原抗體混合物2h。12. 用預冷 PBS清洗三次（3000×g離心1min），收集瓊脂糖珠-抗原抗體復合物，棄上清 。13. 用60μl 2×上樣緩沖液將瓊脂糖珠-抗原抗體復合物懸起，輕輕混勻，緩沖液的量依據上樣多少的需要而定（60 μl足夠上三道）。14. 將上樣樣品煮沸5min，以游離抗原，抗體，珠子，3000×g離心1min，收集上清，也可以暫時于-20℃保存，留待以后電泳，電泳前應再次煮沸5min。詳情請致電咨詢：400-602-0407（轉1號鍵）或登錄公司官網www.wanleibio.cn 溫馨提示：不可用于臨床治療。
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