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活細(xì)胞質(zhì)染色-綠色——Calcein-AM貨號(hào)：C326 3′,6′-Di(O-acetyl)-4′,5′-bis[N,N-bis(carboxymethyl)aminomethyl]fluorescein, tetraacetoxymethyl ester CAS號(hào)：148504-34-1 商品信息 儲(chǔ)存條件：-20度保存 運(yùn)輸條件：室溫 分子式：

C₄₆H₄₆N₂O₂₃

分子量：

994.86

特點(diǎn)：

●活細(xì)胞和死細(xì)胞可同時(shí)染色

●490 nm激發(fā)波長(zhǎng)，515 nm發(fā)射波長(zhǎng)

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湊單關(guān)聯(lián)產(chǎn)品TOP5

NO.1.Cell Counting Kit-8 細(xì)胞增殖毒性檢測(cè)

NO.2. Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)

NO.3. FerroOrange細(xì)胞亞鐵離子檢測(cè)

NO.4. Cellstain- PI細(xì)胞核染色

NO.5. Annexin V, FITC Apoptosis Detection Kit細(xì)胞凋亡檢測(cè)

規(guī)格性狀

規(guī)格

特性：該產(chǎn)物為無(wú)色至微黃色固體，可溶于二甲基亞砜和乙腈。

可溶于二甲基亞砜：試驗(yàn)成功

NMR光譜：試驗(yàn)成功

產(chǎn)品概述

Calcein-AM是一種可對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記的細(xì)胞染色試劑，由于它在Calcein的基礎(chǔ)上加強(qiáng)了疏水性，因此能夠輕易穿透活細(xì)胞膜。當(dāng)其進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)后，酯酶會(huì)將其水解為Calcein留在細(xì)胞內(nèi)，發(fā)出強(qiáng)綠色熒光。與其它同類(lèi)試劑 (如BCECF-AM和Carboxy-fluorescein diacetate) 相比，Calcein-AM是最適合作為熒光探針去染活細(xì)胞的，因?yàn)樗募?xì)胞毒性很低。Calcein不會(huì)抑制任何的細(xì)胞功能如增殖或淋巴球的趨化性。使用了Calcein的活性檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是十分可信并且與標(biāo)準(zhǔn)的51Cr-釋放法所得結(jié)果相一致的。Calcein的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為490nm和515nm。

Calcein-AM可與PI結(jié)合使用，分別對(duì)活細(xì)胞和死細(xì)胞染色，可用于同時(shí)對(duì)活細(xì)胞和死細(xì)胞進(jìn)行熒光染色。

*Caution*

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*警告*

打開(kāi)前請(qǐng)先輕敲試管，并小心打開(kāi)。 在運(yùn)輸過(guò)程中，內(nèi)裝物可能已從試管底部移開(kāi)。

原理

Fig. 1 Cell staining mechanism

產(chǎn)品特性

鈣黃綠素-AM通過(guò)鈣黃綠素的四個(gè)羧基的乙酰氧基甲基酯化（AM轉(zhuǎn)化）而使其可透過(guò)細(xì)胞膜。鈣黃綠素-AM本身幾乎不顯示熒光，但通過(guò)細(xì)胞內(nèi)酯酶水解變成鈣黃綠素。該鈣黃綠素是不透膜的化合物，表現(xiàn)出強(qiáng)的黃綠色熒光（λex=490nm，λem=515nm）。羧基熒光素二乙酸鹽（CFDA）和熒光素二乙酸鹽（FDA）與熒光素-AM具有相同的熒光素骨架，被稱(chēng)為染色活細(xì)胞的染料。但是，這些化合物在顯色后容易從細(xì)胞膜泄漏，這已成為使用中的問(wèn)題之一。與這些染料相比，鈣黃綠素-AM越來(lái)越多地用作顯色后從細(xì)胞泄漏較少的染料。還已知它不抑制細(xì)胞功能，例如淋巴細(xì)胞增殖和白細(xì)胞趨化性。另外，鈣黃綠素-AM在利用殺傷性T細(xì)胞和NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性的測(cè)定中，與使用廣泛使用的放射性同位素的51Cr釋放方法得到相同的結(jié)果，因此細(xì)胞毒性較小。鈣黃綠素-AM對(duì)活細(xì)胞染色，并用于在熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀下觀察，但是當(dāng)與死細(xì)胞染色染料組合使用時(shí)，常用于活細(xì)胞和死細(xì)胞的雙重?zé)晒馊旧apadopoulus等人使用Calcein-AM和Ethidiumhomodimer（EthD-1）進(jìn)行雙重染色，并使用兩種染料的熒光波長(zhǎng)差異通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)研究細(xì)胞毒性。鈣黃綠素-AM目前是用于染色活細(xì)胞的最有用的染料，因?yàn)樗募?xì)胞毒性較小，熒光后細(xì)胞泄漏較少。如上所述，目前正在使用放射性同位素的測(cè)量方法，但是從安全性和便利性的角度出發(fā)，期望使用熒光化合物的細(xì)胞研究的分析將繼續(xù)進(jìn)行。

熒光特性

λex=490 nm, λem=515 nm

操作說(shuō)明

1. 用1ml無(wú)水DMSO溶解1 mg Calcein-AM，制備成1 mmol/l的Calcein-AM母液，-20℃下密閉冷凍保存。

2. 用PBS將Calcein-AM母液稀釋制成1-50 μM的Calcein-AM溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用)。

3. 吸掉預(yù)培養(yǎng)好的細(xì)胞中的培養(yǎng)基，用合適的緩沖液清洗2-3次。^a)

4. 加入適量的Calcein-AM溶液，在37℃培養(yǎng)細(xì)胞15-30分鐘。

5. 用PBS或適當(dāng)?shù)木彌_液洗滌細(xì)胞兩次。

6. 用490 nm激發(fā)波長(zhǎng)，515 nm發(fā)射波長(zhǎng)的濾光片的熒光顯微鏡觀察細(xì)胞。

a) 如果Calcein-AM很難進(jìn)入細(xì)胞，可以使用表面活性劑，如Pluronic? F127。

參考文獻(xiàn)

1) K. McGinnes, G.Chapman, R.Marks and R.Penny, “A Fluorescence NK Assay Using Flow Cytometry”,J.Immunol.Methods,1986,86,7.

2) S.J.Morris,”Real-time Multi-wavelength Fluorescence Imaging of Living Cells”,BioTechniques,1990,8(3),296.

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4) D.M.Callewaert,G.Radcliff,R.Waite,J.Lefevre and D.Poulik,”Characterization of Effector-Target Conjugates for Cloned Human Natural Killer and Human Lymphokine Activated Killer Cells by Flow Cytometry”,Cytometry,1991,12,666.

5) Han-Qing Xie, R.Huang and V.W.Hu, “Intercellular Communication Through Gap Junctions Is Reduced in Senescent Cell”,Biophys.J,1992,62,45.

6) S.A.Weston and C.R.Parish,”Calcein: a Novel Marker for Lymphocytes Which Enter Lymph Nodes”,Cytometry,1992,13,739.

7) X.M.Wang, P.I.Terasaki,G.W. Rankin Jr. ,D.Chia,H.P.Zhong and S.Hardy,”A New Microcellular Cytotoxicity Test Based on Calcein AM Release”,Hum. Immunol.,1993,37,264.

8) N.G.Papadopoulos,G.V.Dedoussis,G.Spanakos,A.D.Gritzapis, C.N.Baxevanis and M.Papamichail,”An Improved Fluorescence Assay for the Determination of Lymphocyte-Mediated Cytotoxicity Using Flow Cytometry”,J.Immunol.Methods,1994,177,101.

9) L.S.De Clerck,C.H.Bridts,A.M.Mertens,M.M.Moens and W.J.Stevens,”Use of Fluorescent Dyes in the Determination of Adherence of Human Leucocytes to Endothelial Cells and the Effects of Fluorochromes on Cellular Function”,J.Immunol. Methods,1994,172,115.

10) H.Ohata,Y.Ujiki and K.Momose,”Confocal Imaging Analysis of ATP-Induced Ca2+Response in Individual Endothelial Cells of the Artery in Situ”,Am.J.Physiol.,1997,272(6),1980.

常見(jiàn)問(wèn)題Q&A

Q1：與51Cr釋放方法有關(guān)嗎

A1: “鈣黃綠素-AM與51Cr釋放方法之間存在相關(guān)性。 以下文件中有一份報(bào)告。N.G.Papadopoulos, et.al.,J.Immunol.Methods, 177,101-111(1994)”

Q2：細(xì)胞染料的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)是多少。

A2：

Q3:細(xì)胞染色試劑Cellstain的哪些活細(xì)胞染色染料可以在細(xì)胞中長(zhǎng)時(shí)間停留？

A3: “就細(xì)胞內(nèi)保留而言，“ CFSE”可以在細(xì)胞中停留最長(zhǎng)時(shí)間。盡管熒光強(qiáng)度降低，但是已經(jīng)證實(shí)細(xì)胞中存在熒光染料達(dá)8周。用“ Calcein-AM”和“ BCECF-AM”觀察到熒光達(dá)3天。也有報(bào)道稱(chēng)“鈣蛋白-AM”在6小時(shí)內(nèi)在細(xì)胞中保留了90％” ?S.A.Weston, et.al., J.Immunol.Methods, 133, 87-97(1990) ?H.P.Zhong, et.al., Hum.Immunol., 37, 264-270(1993)” 但是，“鈣調(diào)蛋白-AM”和“ BCECF-AM”對(duì)細(xì)胞毒活性沒(méi)有影響。 ?L.S.D.Clerck, et.al., J.Immunol.Methods, 172, 115-124(1994) 還要注意的一點(diǎn)是，原始的基本骨架是熒光素，因此由于激發(fā)光而褪色由于容易發(fā)生，因此可能難以通過(guò)長(zhǎng)期激發(fā)來(lái)觀察熒光。 （盡管最好使用防褪色劑等）

Q4：如何使用Calcein-AM。

A4：下面以HeLa細(xì)胞的情況為例進(jìn)行介紹。 根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型和觀察條件考慮并固定試劑濃度。 【試劑】 溶液A：將1mg鈣黃綠素-AM溶于1mlDMSO→1mmol/L溶液 *將溶液存放在-20°C的陰涼處，以防止變質(zhì)。 溶液B：用PBS（-）將溶液A稀釋500倍（用5mLPBS稀釋10μl溶液A得到2μmol/L）。 *Calcein-AM在水溶液中分解，因此在使用前請(qǐng)準(zhǔn)備溶液B。 【操作】 1）用胰蛋白酶-EDTA收集HeLa細(xì)胞并制備細(xì)胞懸液。 2）離心細(xì)胞懸液（1,000rpm，3分鐘） 3）除去上清液并添加PBS（-）（此時(shí)，準(zhǔn)備細(xì)胞數(shù)為105至106細(xì)胞/mL）。 4）用移液器充分分散。 *由于培養(yǎng)液中的血清可能會(huì)升高背景，請(qǐng)執(zhí)行操作2）至4）。 重復(fù)并徹底清洗。 5）將30μl在4）中獲得的細(xì)胞懸液添加至1.5ml微管中。 6）向其中加入15μL[液體B]。 7）蓋上微管并在37°C下孵育15分鐘。 8）將10μL7）的溶液放在蓋玻片上，從上方堆疊蓋玻片，然后將染色的細(xì)胞懸液夾在中間。 9）將蓋玻片放在熒光顯微鏡下，用490nm的濾光片激發(fā)，觀察發(fā)出黃綠色熒光的活細(xì)胞。 （對(duì)于濾光片，如果是490±10nm，則可以觀察到） *排除血清和酚紅，因?yàn)樗鼈兪潜尘啊?/p> *如果背景很高，請(qǐng)清潔它。 *在載玻片上培養(yǎng)的細(xì)胞可以用相同的方式染色和觀察。 *有關(guān)使用PI的雙重染色方法，請(qǐng)參閱方案“我要分別對(duì)活細(xì)胞和死細(xì)胞進(jìn)行染色”。

Q5：我已經(jīng)購(gòu)買(mǎi)了鈣黃綠素-AM（粉末），并希望將其制成溶液。 我該怎么辦？

A5:溶于DMSO。 分子量幾乎為1000，因此，如果將1 mg溶于1 mL DMSO，它將是1 mM的溶液。 請(qǐng)使用盡可能干燥的DMSO。