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Fluo 3-AM試劑貨號(hào)：F026 Fluo3-AM1-[2-Amino-5-(2,7-dichloro-6-acetoxymethoxy-3-oxo-9-xanthenyl)phenoxy]-2-(2-amino-5-methylphenoxy)ethane-N,N,N’,N’-tetraacetic acid, tetra(acetoxymethyl)ester 121714-22-5 商品信息 儲(chǔ)存條件：-20度保存，避光 運(yùn)輸條件：室溫 分子式：

C₅₁H₅₀Cl₂N₂O₂₃

分子量：

1129.85

特點(diǎn)：

●激發(fā)波長(zhǎng)480-500 nm，發(fā)射波長(zhǎng)523-530 nm

●激光共聚焦，流式細(xì)胞儀均可檢測(cè)

選擇規(guī)格： 50ug 50ug*8

產(chǎn)品性狀

規(guī)格

性狀： 本產(chǎn)品為紅色粉末，使用時(shí)將固體溶解于無水DMSO中

純度（HPLC）: 98%以上

熒光光譜圖： 符合實(shí)驗(yàn)要求

NMR光譜圖： 符合實(shí)驗(yàn)要求

處理?xiàng)l件

保存方法 ： 避光冷凍

產(chǎn)品概述

Fluo 3-AM是一種檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的熒光探針。Fluo 3若以游離配體形式存在時(shí)幾乎是非熒光性的，但是當(dāng)它與鈣離子Ca²⁺結(jié)合后熒光會(huì)增加60至80倍，是目前最常用的一種鈣離子熒光探針。激光共聚焦熒光顯微鏡具有氬激光器，所以Fluo 3可被廣泛使用于這種顯微鏡上。這種熒光信號(hào)發(fā)出來的長(zhǎng)波也便于減小對(duì)樣品細(xì)胞的光損傷。Fluo 3也可用來檢測(cè)紫外光照射下可裂解的螯合鈣或其它形式的鈣。Fluo 3-AM是Fluo 3的一種乙酰甲酯衍生物，通過培養(yǎng)，能夠輕易進(jìn)入細(xì)胞中。

原理

Fluo 3-AM (鈣離子熒光探針) 需用無水DMSO (anhydrous DMSO)配制。Fluo 3-AM是一種可以穿透細(xì)胞膜的熒光染料。Fluo 3-AM進(jìn)入細(xì)胞后可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶剪切形成Fluo 3，從而被滯留在細(xì)胞內(nèi)。Fluo 3可以和鈣離子結(jié)合，結(jié)合鈣離子后可以產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光，最大激發(fā)波長(zhǎng)為506nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為526nm

激發(fā)發(fā)射波長(zhǎng)

E x ：480-500 nm

Em：525-530 nm

操作步驟

1、用 HBSS 溶液稀釋 1-5 mmol/l 的 Fluo 3-AM 母液，配制成 1-5 μmol/l的 Fluo 3-AM 工作液

（此濃度僅供參考，請(qǐng)根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)要求自行調(diào)整）。

例如:1 mmol/l 母液配制 1 ml 濃度為 5 μmol/l工作液的方法：用 1 ml HBSS 溶液稀釋 5 μl母液

即可。Fluo 3-AM 工作液需要即配即用，請(qǐng)勿反復(fù)凍存。如果Fluo 3-AM進(jìn)入細(xì)胞的效果不好，

可使用Pluronic^?F-127，后者可以防止Fluo 3-AM在緩沖液里聚合并能促進(jìn)其進(jìn)入細(xì)胞。

*Pluronic^?F-127先用DMSO溶解至濃度為 20%（W/V），然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要直接加入Fluo 3-AM工作液

中至終濃度為 0.04-0.05%（此濃度僅供參考，請(qǐng)根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)要求自行調(diào)整）。

2、取出預(yù)培養(yǎng)的細(xì)胞，除去培養(yǎng)基，用 HBSS 溶液洗滌細(xì)胞 3 次。

如果使用含血清的培養(yǎng)基，血清中的酯酶會(huì)分解 AM 體，從而降低 Fluo 3-AM 進(jìn)入細(xì)胞的效果。

另外含有酚紅的培養(yǎng)基會(huì)使本底值略微偏高，所以加工作液之前需盡量去除培養(yǎng)基殘留。

3、加入 Fluo 3-AM 工作液，溶液量以覆蓋細(xì)胞為準(zhǔn)。

4、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育10-60分鐘，除去Fluo 3-AM工作液。關(guān)于孵育的時(shí)間，如果首次做實(shí)驗(yàn)不能定，

建議先孵育 30 分鐘，看熒光效果：如果細(xì)胞死亡較多，適當(dāng)縮短時(shí)間；如果熒光強(qiáng)度太弱，

適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間。

5、用 HBSS 溶液洗滌細(xì)胞 3 次以充分去除殘留的 Fluo 3-AM 工作液。然后加入 HBSS 溶液覆蓋細(xì)胞。

6、37℃培養(yǎng)箱孵育約 20-30 分鐘，以確保 AM 體在細(xì)胞內(nèi)的完全去酯化作用。

如果細(xì)胞內(nèi)酯酶活性較低，建議嚴(yán)格按照此操作進(jìn)行；酯酶活性高的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，可以忽略此步。

7、用激光共聚焦或熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞，激發(fā)波長(zhǎng) 480-500 nm，發(fā)射波長(zhǎng) 525-530 nm。

注意事項(xiàng)

1、試劑容易吸潮，從冰箱取出后，請(qǐng)確認(rèn)在干燥的環(huán)境放至室溫后再開封。由于試劑極其微量，

開封前，請(qǐng)輕彈管壁幾次，以保證粉末落入管底。

2、第一次使用時(shí), 建議母液即配即用。試劑溶解后盡可能在短時(shí)間內(nèi)使用，以保證實(shí)驗(yàn)效果。

3、溶解液DMSO需要保證新鮮無水，否則將會(huì)導(dǎo)致AM體水解，熒光染料無法進(jìn)入細(xì)胞，影響實(shí)驗(yàn)效果

4、母液遇水極易分解，如果不能一次用完，建議分裝保存，例如分裝成5 μl/管，用封口膜封口，并用鋁

箔紙包裹，放在一個(gè)密閉性能好的塑料袋中，并放入一包干燥劑，在≤-20℃密封避光保存。

5、建議您在正式實(shí)驗(yàn)前先摸索一下細(xì)胞量、鈣離子熒光探針的終濃度、培養(yǎng)時(shí)間等，找到最佳實(shí)驗(yàn)條件

實(shí)驗(yàn)案例

加載了Fluo 3的新鮮分離的大鼠肝臟細(xì)胞PE刺激后出現(xiàn)規(guī)則胞漿鈣振蕩。

上圖為細(xì)胞明場(chǎng)圖和不同時(shí)間點(diǎn)(min)的比例成像，

下圖為影響Fluo 3熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化。

成像系統(tǒng)：Photon Technology International Inc.，

顯微鏡Nikon TE2000U，CCD相機(jī)QuantEM512S,軟件ERP。

(北京師范大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)研究所 崔宗杰教授 提供照片)

數(shù)據(jù)分析

計(jì)算公式：

[Ca²⁺]i = Kd×(F-F_min) / (F_max-F)

[Ca²⁺]i ：細(xì)胞內(nèi)Ca²⁺濃度

Kd：解離常數(shù)

F ：熒光強(qiáng)度

Fmin：Ca²⁺為零狀態(tài)下測(cè)得的熒光比值

Fmax：Ca²⁺為飽和狀態(tài)下測(cè)得的熒光比值

文獻(xiàn)

1) A. Minta, J. P. Y. Kao and R. Y. Tsien, “Fluorescent Indicators for Cytosolic Calcium Based on Rhodamine and Fluorescein Chromophores”, J. Biol. Chem., 1989, 264(14), 8171.

2) J. P. Kao, A. T. Harootunian and R. Y. Tsien, “Photochemically Generated Cytosolic Calcium Pulses and Their Detection by Fluo-3”, J. Biol. Chem., 1989, 264, 8179.

3) M. Eberhard and P. Erne, “Kinetics of Calcium Binding to Fluo-3 by Stopped-Flow Fluorescence”, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1989, 163, 309.

4) A. Hernandez-Cruz, F. Sala and P. R. Adams, “Subcellular Calcium Transients Visualized by Confocal Microscopy in a Voltage-clamped Vertebrate Neuron”, Science, 1990, 247, 858.

5) A. H. Cornell-Bell, S. M. Finkbeiner, M. S. Cooper and S. J. Smith, “Glutamate Induces Calcium Waves in Cultured Astrocytes: Long-Range Glial Signaling”, Science, 1990, 247, 470.

6) D. A. Williams, “Quantitative Intracellular Calcium Imaging with Laser-scanning Confocal Microscopy”, Cell Calcium, 1990, 11, 589.

7) D. A. Williams, S. H. Cody, C. A. Gehring, R. W. Parish and P. J. Harris, “Confocal Imaging of Ionised Calcium in Living Plant Cells”, Cell Calcium, 1990, 11, 291.

8) P. A. Vandenberghe and J. L. Ceuppens, “Flow Cytometric Measurement of Cytoplasmic Free Calcium in Human Peripheral Blood T Lymphocytes with Fluo-3, A New Fluorescent Calcium Indicator”, J. Immunol. Methods, 1990, 127, 197.

10) M. Iino, H. Kasai and T. Yamazawa, “Visualization of Neural Control of Intracellular Ca2+ Concentration in Single Vascular Smooth Muscle Cells in situ”, EMBO J., 1994, 13 (21), 5026.

11) M. E. Dailey and S. J. Smith, “Spontaneous Ca2+ Transients in Developing Hippocampal Pyramidal Cells”, J. Neurobiol., 1994, 25(3), 243.

12) M. Burnier, G. Centeno, E. Burki and H. R. Brunner, “Confocal Microscopy to Analyze Cytosolic and Nuclear Calcium in Cultured Vascular Cells”, Am. J. Physiol., 1994, 266, C1118.

13) E. Donnadieu and L. Y. W. Bourguignon, “Ca2+ Signaling in Endothelial Cells Stimulated by Bradykinin: Ca2+ Measurement in the Mitochondria and the Cytosol by Confocal Microscopy”, Cell Calcium, 1996, 20 (1), 53.

14) M. Ikeda, H. Ariyoshi, J. Kambayashi, K. Fujitani, N. Shinoki, M. Sakon, T. Kawasaki and M. Monden, “Separate Analysis of Nuclear and Cytosolic Ca2+ Concentrations in Human Umbilical Vein Endothelial Cells”, J. Cell. Biochem., 1996, 63 (1), 23.

15) J. E. Merritt, S. A. McCarthy, M. P. A. Davies and K. E. Moores, “Use of fluo-3 to Measure Cytosolic Ca2+ in Platelets and Neutrophils Loading Cells with the Dye, Calibration of Traces, Measurements in the Presence of Plasma, and Buffering of Cytosolic Ca2+”, Biochem. J., 1990, 269, 513.

Q&A

Q1:細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)鈣離子的試劑種類都有什么，選擇什么樣的比較好呢？

A1: 根據(jù)檢測(cè)儀器和檢測(cè)波長(zhǎng)有很多的選擇，產(chǎn)品后面標(biāo)有AM的試劑是可以通過細(xì)胞膜的 有很多種相似的試劑，其特點(diǎn)如下： 【Fura 2】 ?雙波長(zhǎng)激發(fā) 激發(fā)(λex= Ca:340 nm, Ca free:380 nm)、發(fā)射：λem=500 nm ?解離常數(shù)：224 nmol/L ?因?yàn)槭菬晒鈴?qiáng)度的比值、可以有效的減小誤差 =>細(xì)胞內(nèi)Ca濃度計(jì)算。 ?該試劑被使用的最多 ?必須要更換過濾片、會(huì)耽誤一些時(shí)間。 【Fluo 3】 ?單波長(zhǎng)激發(fā) 激發(fā)：λex=508 nm、發(fā)射：λem=527 nm ?解離常數(shù)：400 nmol/L ?因?yàn)榧ぐl(fā)光在長(zhǎng)波段，所以對(duì)細(xì)胞的損傷比較小 （不會(huì)受到NADH、NADPH的影響） ?可以使用Ar激光激發(fā)裝置。 ?不適合切片中鈣離子的檢測(cè) ?【Fluo 4】 ?單波長(zhǎng)激發(fā) ?激發(fā)：λex=495 nm、發(fā)射：λem=518 nm ?解離常數(shù)：360 nmol/L ?與Fluo3相比對(duì)熒光強(qiáng)度更高。 ?因?yàn)榧ぐl(fā)光在長(zhǎng)波段，所以對(duì)細(xì)胞的損傷比較小 ?（不會(huì)受到NADH、NADPH的影響） ?可以使用Ar激光激發(fā)裝置。 ?與Fluo3相比對(duì)細(xì)胞的毒性低 ?【Indo 1】 ?單波長(zhǎng)激發(fā) ?激發(fā)：λex= 330 nm、發(fā)射(λem= Ca:410 nm, Ca free:485 nm) ?解離常數(shù)：250 nmol/L ?由于不需要更換濾光片，可以很快地檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化以及像心肌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)中鈣離子的變化 ?（需要兩臺(tái)檢測(cè)儀器） ?【Rhod 2】 ?單波長(zhǎng)激發(fā) ?激發(fā)：λex=553 nm、發(fā)射：λem=576 nm ?解離常數(shù)：1.0 μmol/L ?因?yàn)榧ぐl(fā)光在長(zhǎng)波段，所以對(duì)細(xì)胞的損傷比較小 ?（不會(huì)受到NADH、NADPH的影響） ?可以使用Ar激光激發(fā)裝置。 ?【Quin 2】 ?單波長(zhǎng)激發(fā) ?激發(fā)：λex=339 nm、發(fā)射：λem=492 nm ?解離常數(shù)：110 nmol/L ?最早開發(fā)的產(chǎn)品