實(shí)驗(yàn)做到崩潰?這 10 個(gè)技巧讓做出發(fā)表級(jí) WB 圖
01
快速處理您的組織
使用干凈的工具收獲和處理組織樣本。要去除可能影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的污染物，請(qǐng)?jiān)诒涞闹行?pH 緩沖液中短暫洗滌。洗滌后，在液氮中快速冷凍組織，以保留蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和特征，例如翻譯后修飾（PTM）。組織樣本可以保存在冰上，以便立即勻漿；然而，由于蛋白質(zhì)降解仍可能在 –20 °C 下發(fā)生，因此組織樣品應(yīng)保存在 –80 °C 以長(zhǎng)期儲(chǔ)存。
02
仔細(xì)選擇裂解緩沖液
在選擇最佳裂解緩沖液以有效地從組織中提取蛋白質(zhì)時(shí)，請(qǐng)考慮 pH、離子強(qiáng)度以及去垢劑和變性劑類型等參數(shù)。RIPA 緩沖液是使用最廣泛的裂解緩沖液。在緩沖液選擇過(guò)程中，還應(yīng)考慮靶蛋白的細(xì)胞定位；例如，對(duì)于細(xì)胞質(zhì)蛋白，推薦使用 Tris-HCl 裂解緩沖液，而 RIPA 是提取核蛋白的首選。為了富集膜、胞質(zhì)或細(xì)胞核部分中的低豐度蛋白質(zhì)，可能需要組織分級(jí)分離。裂解緩沖液的量基于組織的大小/重量；考慮緩沖液與組織的比例對(duì)于確保有效裂解非常重要。首次建立從組織中提取蛋白質(zhì)的方案時(shí)，請(qǐng)嘗試使用不同的裂解緩沖液，以優(yōu)化組織類型和特定蛋白質(zhì)的條件。
03
選擇最佳破碎組織方法
由于與細(xì)胞相比，樣品結(jié)構(gòu)程度更高，因此組織需要更嚴(yán)格的破碎方法，如均質(zhì)化技術(shù)。為了進(jìn)一步解離組織并剪切細(xì)胞 DNA，可能需要對(duì)樣品進(jìn)行超聲處理。在此步驟中避免起泡很重要，因?yàn)樗赡軙?huì)降低您的回收量。確保已優(yōu)化機(jī)械破碎機(jī)的電源設(shè)置并使用預(yù)冷設(shè)備。
由于脂質(zhì)會(huì)影響蛋白質(zhì)免疫印跡的質(zhì)量，因此請(qǐng)確保去除樣品中的脂肪。從植物組織中提取蛋白質(zhì)特別具有挑戰(zhàn)性，因?yàn)樗鼈兏缓鞍酌覆⑶液懈咚降拇x物，可以干擾蛋白質(zhì)提取（Wang 等人，2008）。提取過(guò)程必須針對(duì)您使用的特定植物組織進(jìn)行優(yōu)化。已經(jīng)為植物組織開(kāi)發(fā)了幾種蛋白質(zhì)提取方案，例如三氯乙酸/丙酮沉淀法或基于苯酚的提取（Wang 等人，2008）。
04
在樣品制備過(guò)程中抑制蛋白質(zhì)降解并保留翻譯后修飾
細(xì)胞膜的破壞釋放出可以降解蛋白質(zhì)的酶，盡管通過(guò)將樣品保持在低溫下來(lái)最小化其活性（Scopes 1994）。為了限制蛋白酶活性，可以在緩沖液中加入強(qiáng)變性劑，如尿素。然而，這些條件可能會(huì)影響某些蛋白質(zhì)的完整性；因此，裂解緩沖液常規(guī)補(bǔ)充蛋白酶抑制劑混合物。常見(jiàn)的蛋白酶抑制劑包括（PMSF），aprotinin，leupeptin，and pepstatin。
SUMO 化蛋白的鑒定可能特別具有挑戰(zhàn)性。這是由于去除 SUMO 偶聯(lián)物的異肽酶的活性，并且通常只有一小部分蛋白質(zhì)被 SUMO 化。因此，為了保存 SUMO 化，建議在裂解緩沖液中添加 isopeptidase inhibitors（Xiao 等人，2015）。泛素偶聯(lián)物的去除也很容易通過(guò)蛋白質(zhì)泛素水解酶（稱為去泛素酶（DUB））發(fā)生。因此，必須在細(xì)胞裂解緩沖液中添加 EDTA 或 EGTA 以及碘乙酰胺（IAA）或 N-乙基馬來(lái)酰亞胺（NEM）。IAA 和 NEM 通常以 5～10 mM 的濃度使用。然而，高達(dá)十倍的高濃度對(duì)于維持某些蛋白質(zhì)的泛素化至關(guān)重要，例如 IRAK1（Emmerich 和 Cohen 2015）。用蛋白酶體抑制劑 MG132 處理也保留泛素化并阻止 26S 蛋白酶體的蛋白質(zhì)降解（Kisselev 等人，2012）。
05
在凝膠上樣前定量樣品
測(cè)定樣品濃度可確保凝膠的上樣量相等，并使您能夠比較處理樣品與未處理樣品中或?qū)嶒?yàn)時(shí)間過(guò)程中蛋白質(zhì)水平的差異。Bradford assays，如 Bio-Rad 的 Quick Start Bradford Protein Assay，可用于每孔總蛋白質(zhì)上樣量的標(biāo)準(zhǔn)化。
06
尋找最好的凝膠
確定最適合目標(biāo)蛋白的凝膠的一個(gè)很好的起點(diǎn): 根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量選擇聚丙烯酰胺百分比。例如，對(duì)于高分子量，選擇低百分比，對(duì)于低分子量，選擇高百分比。如果要檢測(cè)單個(gè)蛋白質(zhì)，請(qǐng)選擇非梯度凝膠。當(dāng)需要可視化一系列蛋白質(zhì)大小時(shí)，選擇梯度凝膠。非常高的電壓設(shè)置可能會(huì)導(dǎo)致凝膠「微笑」；為避免這種影響，請(qǐng)?jiān)诶洳厥抑须娪灸z并使用預(yù)冷的電泳緩沖液。
07
驗(yàn)證蛋白質(zhì)上樣量
根據(jù)蛋白質(zhì)的細(xì)胞定位選擇最佳上樣對(duì)照。細(xì)胞質(zhì)蛋白的常用上樣對(duì)照包括管家蛋白，例如 beta-actin 或 beta-tubulin；對(duì)于核蛋白，通常使用 histone H1 或 histone H3。近年來(lái)，許多研究報(bào)告了一些最常用的管家蛋白不適合當(dāng)做可靠的蛋白質(zhì)歸一化，強(qiáng)調(diào)生理和病理因素會(huì)影響它們的表達(dá)水平（Ferguson 等人，2005）。為了使加載歸一化有意義，必須在不同的實(shí)驗(yàn)條件下保持恒定的水平；例如，加載控件的表達(dá)不應(yīng)受到處理的影響。即使在單個(gè)組織樣本中，beta-actin 表達(dá)也被證明不是均勻的（Eaton 等人，2013）。此功能突出了使用管家蛋白進(jìn)行比較蛋白質(zhì)水平分析的問(wèn)題。
管家蛋白的另一個(gè)常見(jiàn)問(wèn)題是過(guò)載，這會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)超出動(dòng)態(tài)范圍。樣品的動(dòng)態(tài)范圍取決于組織和蛋白質(zhì)測(cè)定方法。
Bio-Rad 的免染成像技術(shù)是 Bio-Rad 的免染成像技術(shù)，是用染料（如 Ponceau S）觀察蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)裝載可視化的一個(gè)很好的替代方案。該技術(shù)能夠?qū)⒚總€(gè)泳道中的條帶標(biāo)準(zhǔn)化為總蛋白質(zhì)（圖 1，Taylor 等人，2013）。該方法快速，并使用摻入凝膠中的轉(zhuǎn)利染料使蛋白質(zhì)在 UV 激發(fā)時(shí)發(fā)出熒光。與 Ponceau S 染色相比，免染技術(shù)提供了更大的線性范圍并減少了可變性（Rivero-Gutierrez 等人，2014 年）。此外，由于不需要對(duì)印跡進(jìn)行染色，因此非常方便。
圖 1. 通過(guò)免染技術(shù)為總蛋白質(zhì)測(cè)量提供線性動(dòng)態(tài)范圍。A，HeLa 細(xì)胞裂解物稀釋 80～2.5 μg 總蛋白。B，HeLa 細(xì)胞裂解物從 20～1 μg 總蛋白稀釋。
08
考慮膜類型
蛋白質(zhì)可以轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素或 PVDF 膜上。PVDF 膜具有很高的機(jī)械強(qiáng)度，最適合需要膜剝離和重新剝離的情況。PVDF 具有疏水性，需要預(yù)浸泡在甲醇中。硝酸纖維素膜具有高信噪比，不需要甲醇預(yù)處理。需要注意的是，硝酸纖維素膜不能與含有 SDS 的轉(zhuǎn)印緩沖液一起使用。在選擇膜類型時(shí)，您可能還需要考慮其他參數(shù)，例如孔徑，這些參數(shù)會(huì)影響較大蛋白質(zhì)與較小蛋白質(zhì)的結(jié)合效率。
09
降低內(nèi)源性免疫球
蛋白的高背景
在對(duì)組織裂解物進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)時(shí)，來(lái)自內(nèi)源性 IgG 和非特異性二抗結(jié)合的信號(hào)可能會(huì)掩蓋對(duì)低豐度蛋白質(zhì)或特定分子量蛋白質(zhì)的檢測(cè)。對(duì)于 ~50 kD 和 ~25 kD 的蛋白質(zhì)尤其如此，它們可能會(huì)被組織樣品制備的變性和還原步驟中產(chǎn)生的 IgG 重鏈和輕鏈所掩蓋。
然后，IgG 鏈由與 IgG 重鏈和輕鏈結(jié)合的常規(guī)二抗常規(guī)檢測(cè)。當(dāng)使用組織樣本（例如胸腺或甲狀腺）時(shí)，這個(gè)問(wèn)題最為明顯，這些樣本是免疫系統(tǒng)的一部分，因此含有大量的內(nèi)源性免疫球蛋白（圖 2）。
TidyBlot 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)試劑（STAR209P 和 STAR209PA）僅與用于蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)的天然抗體結(jié)合，因此為生成干凈的組織裂解物印跡提供了良好的解決方案。
圖 2. 使用 Immun-Star 山羊抗小鼠（GAM）-HRP 抗體對(duì)不同的組織裂解物進(jìn)行背景染色。
10
包括合適的組織對(duì)照
為了確保一抗的特異性，使用陽(yáng)性和陰性組織對(duì)照非常重要。對(duì)于陽(yáng)性對(duì)照，請(qǐng)使用文獻(xiàn)中指出表達(dá)高水平目標(biāo)蛋白的組織類型、過(guò)表達(dá)目標(biāo)蛋白標(biāo)記的小鼠組織或重組蛋白。推薦的陰性對(duì)照包括僅二抗對(duì)照（省略一抗孵育步驟）和已知不表達(dá)靶蛋白的組織樣品。包括特定的敲除樣本或組織特異性敲除小鼠模型，通過(guò)顯示未在某種組織類型中檢測(cè)到靶標(biāo)來(lái)確認(rèn)抗體的特異性可能會(huì)有所幫助。
您還需要意識(shí)到，在疾病狀態(tài)下存在特定蛋白質(zhì)表達(dá)的定量差異;科學(xué)文獻(xiàn)中常見(jiàn)的一種現(xiàn)象。為了解釋這些差異，您可以包括來(lái)自健康和疾病組織的樣本來(lái)分析異常表達(dá)。
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