新冠疫情之下，“測(cè)核酸”已成為全民熱詞，PCR作為測(cè)核酸的官宣儀器也火爆熱賣，這里指的是熒光定量PCR（qPCR）。
大家知道，有時(shí)的“漏檢”是因?yàn)椴《镜腸opy數(shù)太低；而若想減少甚至消除“漏檢”，可用另一種更靈敏更精準(zhǔn)的數(shù)字PCR（digital PCR，dPCR）技術(shù)。
dPCR和qPCR到底有何區(qū)別？
為什么說dPCR的效果更好？
它能解決哪些問題？
國內(nèi)外有哪些dPCR的玩家？
本文將揭秘dPCR的前世今生，并對(duì)市場(chǎng)上dPCR的代表性產(chǎn)品逐一展示，希望能為您下次入囊前做點(diǎn)兒準(zhǔn)備。
PCR定量發(fā)展簡史
PCR即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction），它以DNA雙鏈復(fù)制原理為基礎(chǔ)，對(duì)特定核酸樣本進(jìn)行體外擴(kuò)增，能夠?qū)⑽⒘康暮怂針颖狙杆倏截愔翈装偃f倍。
自1985年美國科學(xué)家Kary Mullis發(fā)明PCR以來的三十多年，PCR經(jīng)歷了三代技術(shù)的發(fā)展。
第一代與第二代
第一代傳統(tǒng)PCR技術(shù)，采用瓊脂糖凝膠電泳的方法對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行定性分析；第二代熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)，通過在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)的積累實(shí)時(shí)監(jiān)控PCR進(jìn)程，最后用進(jìn)入擴(kuò)增指數(shù)期時(shí)的Cq值（羅氏）或Ct值（AB/賽默飛）對(duì)基因進(jìn)行定量分析。
為何第一代PCR只能定性？
這是因?yàn)镻CR反應(yīng)事實(shí)上呈現(xiàn)S型，在反應(yīng)終點(diǎn)區(qū)測(cè)定終點(diǎn)產(chǎn)物的數(shù)量誤差很大，因此只能定性。第二代qPCR利用拐點(diǎn)產(chǎn)物數(shù)量定量，重現(xiàn)性好，當(dāng)結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線后，可以實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量。這同分析化學(xué)上講的定量方法并無區(qū)別，實(shí)現(xiàn)定量，需要找到標(biāo)準(zhǔn)樣品，需要做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
第三代
下面我們重點(diǎn)說說神奇的第三代數(shù)字PCR（dPCR）技術(shù)。
這種定量技術(shù)，既不需要標(biāo)準(zhǔn)品，也不需要做標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)起始樣本的絕對(duì)定量，靈敏度和準(zhǔn)確度還特別高。縱觀當(dāng)今分析技術(shù)，唯有dPCR可以實(shí)現(xiàn)不需標(biāo)準(zhǔn)曲線的絕對(duì)定量，足可笑傲定量江湖，用降維打擊、一舉封神、YYDS等各種贊譽(yù)來形容它都挺合適。
dPCR的基本原理是：通過將PCR反應(yīng)液進(jìn)行有限稀釋，實(shí)現(xiàn)核酸分子的單分子擴(kuò)增，最終采取終點(diǎn)法檢測(cè)陽性微滴的熒光信號(hào)，有熒光信號(hào)的微滴判讀為 1；沒有熒光信號(hào)的微滴判讀為 0，因此該技術(shù)被稱為數(shù)字PCR。
簡而言之，就是把復(fù)雜的定量工作簡化成“1”和“0”，沒有尋找標(biāo)準(zhǔn)品的困擾，沒有做標(biāo)準(zhǔn)曲線的煩惱，把所有人為誤差統(tǒng)統(tǒng)丟掉，這就是dPCR被譽(yù)為PCR技術(shù)之未來的底氣。
dPCR的誕生
1992年，Sykes等在檢測(cè)復(fù)雜背景下低豐度的IgH重鏈突變基因時(shí)，利用樣品的有限稀釋，讓每個(gè)微孔只獲得單個(gè)模板分子，通過計(jì)算PCR后的擴(kuò)增信號(hào)，以期準(zhǔn)確確定原始分子的數(shù)量。雖然沒有明確提出“數(shù)字PCR”的概念，但是已經(jīng)建立了數(shù)字PCR基本的實(shí)驗(yàn)流程，并且確定了數(shù)字PCR檢測(cè)中一個(gè)極其重要的原則——以“終點(diǎn)信號(hào)的有或無”作為定量方法，這是數(shù)字PCR的雛形。
1999年，霍普金斯大學(xué)的Bert Vogelstein和他的同事Kenneth Kinzler等在分析癌癥突變的罕見基因型過程時(shí)，因受到體細(xì)胞基因的干擾，而遇到檢測(cè)靈敏度和檢測(cè)分辨率的瓶頸，采用了在384孔板中對(duì)每個(gè)反應(yīng)孔的樣品量進(jìn)行極限稀釋并增加反應(yīng)孔數(shù)進(jìn)行檢測(cè)的方式，從而明確提出了數(shù)字式PCR（dPCR）的概念，同時(shí)也提出如果采用更多孔板其檢測(cè)靈敏度會(huì)更高，從而指出了dPCR系統(tǒng)的發(fā)展方向。
dPCR是PCR技術(shù)上里程碑式的飛躍，其概念被提出后，受限于當(dāng)時(shí)的技術(shù)條件，如樣本稀釋及分配都是靠手工來完成的，干擾和限制因素較多；并且結(jié)果分析對(duì)于研究者來說也十分枯燥與繁瑣，因此在很長一段時(shí)間dPCR發(fā)展停滯不前。
后來由于微流控技術(shù)與微納集成制造工藝的發(fā)展解決了dPCR應(yīng)用過程中的幾個(gè)關(guān)鍵技術(shù)問題，推動(dòng)了dPCR的研究與商業(yè)化的發(fā)展。
細(xì)說dPCR原理
數(shù)字PCR的基本原理是：將稀釋的核酸樣品分配到大量獨(dú)立的微反應(yīng)單元，進(jìn)行大規(guī)模單拷貝PCR擴(kuò)增反應(yīng)和基于泊松分布（Poisson distribution）的絕對(duì)定量分析。
與RT-qPCR不同，dPCR不需要使用標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可實(shí)現(xiàn)目的核酸拷貝數(shù)的絕對(duì)定量。dPCR平臺(tái)是基因和細(xì)胞治療的標(biāo)配，在載體開發(fā)中可以用作質(zhì)量控制檢測(cè)。
目前根據(jù)dPCR樣本稀釋分配的方式，基本可分為三大類：一種是基于大規(guī)模集成的微流控芯片；第二種是使用微反應(yīng)室/孔板；第三種是基于液滴式。
其中后者是近年來dPCR分析儀的主流。液滴數(shù)字PCR（ddPCR）是一種基于水油乳液液滴技術(shù)的dPCR方法，其將樣品分餾成20,000個(gè)液滴，并在每個(gè)液滴中發(fā)生模板分子的PCR擴(kuò)增。ddPCR 技術(shù)使用的試劑和工作流程與大多數(shù)基于TaqMan探針的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)有著相似的試劑和工作流程。大規(guī)模樣本分區(qū)是dPCR 技術(shù)的一個(gè)關(guān)鍵方面，不論是芯片式還是液滴式，其基本原理都是將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應(yīng)器或者液滴當(dāng)中，每個(gè)反應(yīng)器的核酸模板數(shù)少于1或者等于1。經(jīng)過PCR擴(kuò)增之后，有一個(gè)核酸分子模板的反應(yīng)器就會(huì)給出熒光信號(hào)，沒有模板的反應(yīng)器沒有熒光信號(hào)。根據(jù)相對(duì)比例和反應(yīng)器的體積，可以推算出原始溶液的核酸濃度。
dPCR的主要技術(shù)特點(diǎn)
dPCR具有靈敏度高（可達(dá)0.001-0.0001%），特異性強(qiáng)，可檢測(cè)復(fù)雜背景下的靶標(biāo)序列；可高度耐受PCR反應(yīng)抑制劑，如SDS（十二烷基磺酸鈉）、EDTA（乙二胺四乙酸）、Heparin（肝素，血液抗凝劑）等；不必依賴對(duì)照品或標(biāo)準(zhǔn)品，可對(duì)目標(biāo)拷貝數(shù)直接進(jìn)行精確定量，分析微小的濃度差異；實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析便捷，每個(gè)微滴的檢測(cè)結(jié)果以陰性、陽性判讀，數(shù)據(jù)分析自動(dòng)化；可統(tǒng)計(jì)突變率，通過統(tǒng)計(jì)分析可得出靶點(diǎn)的突變率。
作為近年來興起的分子診斷分析技術(shù)，dPCR在應(yīng)用技術(shù)上還存在需要改進(jìn)的地方，如通量較低，一般單個(gè)反應(yīng)2重反應(yīng)效果最佳；dPCR優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，但是對(duì)于DNA濃度大的樣本來說優(yōu)勢(shì)就不能體現(xiàn)，而且核酸濃度高時(shí)，每個(gè)微滴里面包含的拷貝數(shù)不符合泊松分布；dPCR雖然不依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線，但是每次反應(yīng)之間存在差異，短期內(nèi)不能完全取代qPCR，也不能代替其他金標(biāo)準(zhǔn)方法。
dPCR儀在細(xì)分領(lǐng)域的應(yīng)用前景
dPCR技術(shù)的出現(xiàn)不是為了完全取代原有分子診斷技術(shù)，而是更好的補(bǔ)充和完善現(xiàn)有技術(shù)平臺(tái)。dPCR為不同應(yīng)用場(chǎng)景下的多樣化核酸檢測(cè)需求提供了新的思路，尤其是在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)方面，在感染性疾病早期檢測(cè)、癌癥的液體活檢、無創(chuàng)產(chǎn)前檢查等領(lǐng)域展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。
dPCR的優(yōu)勢(shì)與臨床應(yīng)用前景已在許多研究中得到確認(rèn)，但最終實(shí)現(xiàn)在臨床上的廣泛應(yīng)用，需要以下幾個(gè)方面進(jìn)行升級(jí)：商用dPCR系統(tǒng)需要進(jìn)一步提升樣本檢測(cè)通量以充分滿足病毒篩查的需求；需要制定國家或行業(yè)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。目前新羿生物已經(jīng)推動(dòng)了dPCR的地方標(biāo)準(zhǔn)（DB 32/T3762.16-2001 新型冠狀病毒檢測(cè)技術(shù)規(guī)范第16法：核酸數(shù)字PCR），用于新冠病毒檢測(cè)；需要產(chǎn)業(yè)界進(jìn)一步降低設(shè)備成本；基于dPCR的新冠檢測(cè)試劑盒需要經(jīng)過嚴(yán)格評(píng)價(jià)，并獲得NMPA、FDA、CE等監(jiān)管機(jī)構(gòu)的認(rèn)證才可投放國內(nèi)或海外市場(chǎng)。
實(shí)現(xiàn)感染性疾病早期高效檢測(cè)
——以新冠病毒為例
（1）病毒檢測(cè)。qPCR檢測(cè)技術(shù)是目前新冠病毒檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但由于病毒探針結(jié)合位點(diǎn)突變、樣本病毒載量不足等原因，在臨床檢測(cè)過程中經(jīng)常出現(xiàn)假陰性結(jié)果，由于dPCR具有更高的靈敏度、精準(zhǔn)度，以及其適合痕量樣本檢測(cè)的特性，能夠糾正RT-qPCR檢測(cè)出的“假陰性”結(jié)果，作為后者的補(bǔ)充方法。
（2）臨床樣本病毒載量評(píng)估。在人群篩查及臨床診療中，為科學(xué)選取采樣方式，需要評(píng)估不同臨床樣本病毒載量，如鼻咽拭子、血尿、糞便、肺泡灌洗液等，由于dPCR可提供絕對(duì)量化指標(biāo)，為采樣方法的選取提供了參考，從而提高檢出率。
（3）監(jiān)測(cè)環(huán)境病毒載量。在外防輸入的戰(zhàn)略要求下，環(huán)境病毒檢測(cè)尤為重要。dPCR可對(duì)低核酸豐度樣本進(jìn)行有效檢測(cè)，包括從不同環(huán)境中取樣的樣本，如病房、衛(wèi)生間、實(shí)驗(yàn)室等等，在疫情防控中起到了不可忽視的作用。此外，dPCR的應(yīng)用場(chǎng)景還有病程不同階段的病毒載量評(píng)估、核酸參考品制備、抗病毒藥物研發(fā)等環(huán)節(jié)。
助力癌癥液體活檢
——實(shí)現(xiàn)患者全病程監(jiān)控
液體活檢是普通癌癥檢測(cè)的延伸和補(bǔ)充方法，將目標(biāo)采取樣本從組織延伸到血液、體液。dPCR可精確檢測(cè)轉(zhuǎn)移到血液循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞和DNA片段，提供基因突變情況等信息，動(dòng)態(tài)監(jiān)控病人病程的發(fā)展，從而為伴隨診斷和個(gè)性化治療提供可靠依據(jù)。
高效篩查胎兒疾病
——提高無創(chuàng)產(chǎn)檢普及性和依從性
通過無創(chuàng)產(chǎn)前檢查，針對(duì)胎兒染色體非整倍體異常、遺傳性基因疾病等進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。目前，大多數(shù)商品化的無創(chuàng)產(chǎn)前檢查產(chǎn)品都是基于二代測(cè)序的技術(shù)和平臺(tái)，該方法檢測(cè)周期長（1-2周出報(bào)告）、技術(shù)門檻高、檢測(cè)費(fèi)用高，阻礙了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用。而基于dPCR的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)技術(shù)有望實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、快速、簡便的產(chǎn)前篩查。
dPCR的市場(chǎng)分布及預(yù)測(cè)
全球市場(chǎng)分布和預(yù)測(cè)
目前數(shù)字PCR市場(chǎng)規(guī)模并不大，全球約1.5億至2.5億美元，占實(shí)時(shí)定量熒光PCR市場(chǎng)總規(guī)模(約20億美元)的10%，但增長趨勢(shì)顯著，有望在技術(shù)成熟后與目前的qPCR平分江山，甚至逐步替代qPCR技術(shù)。
研究報(bào)告預(yù)測(cè)，2019-2024年全球qPCR和dPCR市場(chǎng)將以8.8%的年復(fù)合增長率增長，從2014年的41.13億美元增長到2024年的62.7億美元。其中，dPCR的增速更快達(dá)11.9%，將從2014年的4.75億美元，增長到2024年8.34億美元；qPCR的年增速為8.37%，從2014年的36.28億美元，增長到2024年的54.37億美元。這個(gè)預(yù)測(cè)沒有料及2020年新冠疫情的爆發(fā)，為PCR檢測(cè)帶來極大的市場(chǎng)。
從市場(chǎng)的角度來看，北美依然是dPCR最大的主導(dǎo)市場(chǎng)，其次是亞洲和歐洲。北美市場(chǎng)增長是由于北美地區(qū)存在慢性病的高患病率和完善的醫(yī)療保健基礎(chǔ)設(shè)施等。此外，有利的政府舉措和研究伙伴關(guān)系數(shù)量的增加，是預(yù)計(jì)市場(chǎng)增長的驅(qū)動(dòng)因素。
把企業(yè)類型分為三檔，其中第一檔為收入大于10億美元企業(yè)。第二檔為1億至10億美元，第三檔為小于1億美元，分別占有45%，34%，21%，這說明該行業(yè)存在巨頭，但是尚未形成壟斷，對(duì)于相對(duì)其他企業(yè)仍有機(jī)會(huì)。dPCR由幾個(gè)主要公司占據(jù)一半的全球市場(chǎng)，包括Bio-Rad Laboratories Inc.，Thermo Fisher Scientific，F(xiàn)luidigm Corporation，QIAGEN，Sysmex Corporation，JN Medsys，Merck KGaA，Stilla和Avance Biosciences等。
ddPCR是近年來PCR的主流技術(shù)，推動(dòng)細(xì)分市場(chǎng)增長的因素是癌癥，傳染病的患病率增加以及檢測(cè)中心資金的增加。
中國市場(chǎng)分布和預(yù)測(cè)
在精準(zhǔn)醫(yī)療、個(gè)性化用藥等需求推動(dòng)下，分子診斷技術(shù)在全球得到飛速發(fā)展。我國dPCR行業(yè)一直保持著穩(wěn)定快速的增長。根據(jù)沙利文(Suvillian)數(shù)據(jù)顯示，中國dPCR行業(yè)市場(chǎng)規(guī)模從2013年的14.6億元增加至2017年的72億元，年復(fù)合增長率CAGR=29.2%，到2022年市場(chǎng)規(guī)模預(yù)計(jì)將達(dá)到266.6億元人民幣。
國內(nèi)dPCR行業(yè)市場(chǎng)規(guī)模持續(xù)快速增長，主要受到精準(zhǔn)診斷需求增加、技術(shù)突破增加利潤、國家政策支持（國產(chǎn)替代）等因素影響，未來dPCR將會(huì)有更大的發(fā)展空間，這是因?yàn)?/p>
（1）人口增長與老齡化：我國人口老齡化趨勢(shì)導(dǎo)致腫瘤醫(yī)藥市場(chǎng)增長和體外檢測(cè)需求增長，而dPCR在腫瘤檢測(cè)、傳染病檢測(cè)、遺傳病等疾病檢測(cè)上優(yōu)勢(shì)明顯，醫(yī)療市場(chǎng)的擴(kuò)容將進(jìn)一步推動(dòng)dPCR的增長；
（2）國內(nèi)政策利好：根據(jù)國家科技部辦公廳發(fā)布的《“十三五”醫(yī)療器械科技創(chuàng)新專項(xiàng)規(guī)劃》，要求重點(diǎn)開發(fā)POCT檢測(cè)、新型基因測(cè)序儀、隨檢全自動(dòng)核酸檢測(cè)系統(tǒng)、定量dPCR等系統(tǒng)；
（3）精準(zhǔn)醫(yī)療與腫瘤治療需求：精準(zhǔn)醫(yī)療的基礎(chǔ)在于個(gè)體化醫(yī)療，對(duì)致病突變檢測(cè)和定量分析的精確性要求較高，亟需新一代PCR技術(shù)的應(yīng)用，而數(shù)字PCR在這方面優(yōu)勢(shì)明顯。
dPCR的主要產(chǎn)品
自2006年，F(xiàn)luidigm公司推出第一個(gè)商業(yè)化的基于芯片的dPCR儀以來，數(shù)字PCR儀不斷實(shí)現(xiàn)創(chuàng)新和突破。在稀釋方式上，主要的是伯樂為代表的液滴式、以Fluidigm、賽默飛為代表的芯片式和羅氏、凱杰為代表的微板式。
國外dPCR主要是三個(gè)模塊組成的一體機(jī)，而國內(nèi)大多還是幾臺(tái)儀器分別完成樣本分區(qū)、擴(kuò)增和數(shù)據(jù)讀取。新冠疫情下，dPCR生產(chǎn)商無不在產(chǎn)品上實(shí)現(xiàn)突破，近年來新品頻出，直有問鼎分子診斷之勢(shì)。
Bio-Rad
伯樂
擁有二十多年P(guān)CR儀研發(fā)、生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)的伯樂公司是全球dPCR市場(chǎng)的領(lǐng)跑者。伯樂于2011年斥資1.62億美元，完成對(duì)QuantaLife公司的收購，正式進(jìn)軍dPCR市場(chǎng)，隨即推出QX100、QX200微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)以及最新的QX One集成液滴數(shù)字系統(tǒng)。
2017年，伯樂又收購了ddPCR系統(tǒng)制造商RainDance Technologies，該公司擁有在短時(shí)間內(nèi)生成數(shù)百萬個(gè)皮升級(jí)微液滴的核心技術(shù)，可將伯樂原液滴數(shù)提升250-500倍。兩者的融合進(jìn)一步穩(wěn)固了伯樂在dPCR領(lǐng)域的領(lǐng)軍地位。
根據(jù)2019年財(cái)報(bào)，伯樂銷售額收入超23億美元，ddPCR增長強(qiáng)勁。2020年，Bio-Rad發(fā)布了全球首款數(shù)字PCR一體機(jī)：Bio-Rad的 QX ONE ddPCR系統(tǒng)，整合了微滴生成、熱循環(huán)反應(yīng)及微滴讀取等步驟，最大程度減少人工操作，提高了檢測(cè)通量。配備四個(gè)獨(dú)立的熒光通道，結(jié)合ddPCR特有的高階多重PCR技術(shù)，可以在單反應(yīng)孔中實(shí)現(xiàn)8重拷貝數(shù)變異（CNV）檢測(cè)、5重突變檢測(cè)或4重基因表達(dá)檢測(cè)。兼容目前QX200 系統(tǒng)中所使用的supermix、assay和kit。
美國FDA近來批準(zhǔn)了Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的基于ddPCR技術(shù)的SARS-CoV-2檢測(cè)的緊急使用授權(quán)。
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