方法一:磁珠法提純mRNA
一：儀器 水浴離心機(jī) 取液器 分光光度計(jì)
二：試劑 mRNA 分離系統(tǒng)試劑盒,異丙醇， 3MNaAC
三:磁珠法分離mRNA的原理圖示如下：
四：操作
（一 ）生物素標(biāo)記的Oligo(dT)探針與mRNA的煺火
１：在DEPC處理過的1.5mlEppendof管中，加入0.2-1mg的總RNA和無RNase的水至終體積為0.5ml。
２：65℃加熱10min
３：加入2μl生物素標(biāo)記的Oligo(dT)探針和12μl的20×SSC于RNA中輕輕混勻，室溫放置，逐漸冷卻平衡至室溫，此步操作一般需10min。
（二）親和素順磁磁珠（SA-PMPS）的沖洗
4：將SA-PMPS輕晃開后，放入磁性分離架中，使SA-PMPS集中于試管一則(約30秒)， 小心去除上清（不用離心方法）用1.5ml0.5×SSC漂洗SA-PMPS，用磁性分離架集中磁珠，去除上清，漂洗３次。
5：將漂洗過的SA-PMPS重新懸浮于0.2ml0.5×SSC中。
雜交體的生成及漂洗
6：將上步"３"中褪火的生物素標(biāo)記的Oligo(dT)探針，全部加到上步"5"管中,輕輕混勻，室溫放置10min。每隔2分鐘輕輕混勻一次
7：用磁性分離架捕獲磁珠，吸棄上清。
8：用0.3ml0.1×SSC漂洗SA-PMPS，用磁性分離架集中磁珠，吸棄上清，漂洗4次。
（三）洗滌收集mRNA
9：將漂洗過的SA-PMPS重新懸浮于0.2mlDEPC水中。
10：用磁性分離架捕獲磁珠，將洗脫的水相吸至一新管中。重復(fù)洗滌一次，吸取水相，兩次水相合并(約0.25ml)
11：在洗脫液中加入0.1體積的NaAC,1體積的異丙醇，－２０℃沉淀過夜，12000g 離心10min,75%乙醇洗沉淀，真空干燥。
12：提取mRNA質(zhì)量的分光光度計(jì)檢測，將所提mRAN分別在260,280nm比色，要求A：OD260％/ OD280％不小于2.0及40μg所提樣品在OD260％的值為1 .
13:提取mRNA質(zhì)量的電泳檢測，在1%的變性膠上，EB染色后，mRNA應(yīng)在0.5-8Kb間均勻著色，1.5-2Kb間著色較強(qiáng)。
方法二:親和柱層析法提純mRNA
該方法利用mRNA上的寡聚A可與較聯(lián)寡聚T的纖維素柱在高鹽下以堿基配對形式發(fā)生親和吸附，而在低鹽下，堿基配對能力破壞，吸附解除，而其他成分的RNA則不具該特性，因此在高鹽下當(dāng)RNA抽提樣品流經(jīng)該柱時，mRNA被掛在柱上，而其他RNA則隨高鹽溶液流出；當(dāng)用低鹽洗脫液洗柱時，mRNA隨洗脫液流出。再用有機(jī)溶劑沉淀則可得純化mRNA。
一：儀器，層析系統(tǒng)，其他同方法一
二：試劑，
柱材Oliga(dT）－纖維素
上樣液：20mMTris-HCL(pH 7.6)
0.5M NaCL
1mM EDTA (pH 8.0)
0.1% 十二烷基肌氨酸鈉（SLS）
洗脫液：10mM Tris-HCL(pH 7.6)
1mM EDTA(pH 8.0)
0.05% SDS
三：操作
1：DEPC處理層析柱
2：0.1M NaOH處理Oliga(dT）－纖維素
3：用1×上樣液洗柱至pH< 8.0
4:無菌水溶解RNA，65℃溫浴5分鐘后，迅速冷卻至室溫，加等體積2×上樣液，上樣，分部收集。
5：1倍體積1×上樣液洗柱，分部收集。
6：OD260沉淀收集液，確定收集液的該值是否接近0，如該值仍很大，則上樣液繼續(xù)洗柱，直至該值接近0。
7：2－3倍柱床體積的洗脫液，洗柱，分部收集。
8：測定各收集管的OD260，將有吸光值的各管合并。
9：進(jìn)行方法一的“11－13”步。
? 如需詢價，請加客服QQ：1749072012 、客服微信：jinshanbio，或發(fā)送郵件到1749072012@qq.com
? 平臺為生命科學(xué)研究相關(guān)領(lǐng)域提供一站式耗材試劑儀器解決方案和采購服務(wù)，數(shù)據(jù)資源基于CC協(xié)議。
? 本文地址：http://m.yeybxjkgt.cn/thread-48982.htm
特別聲明：以上內(nèi)容(如有圖片亦包括在內(nèi))來源于授權(quán)廠家或網(wǎng)絡(luò)，如有侵權(quán)，請聯(lián)系客服刪除，本平臺不提供信息校正和存儲服務(wù)。
Notice: The content above (including the pictures if any)comes from authorized manufacturers or networks. In case of infringement, please contact to delete it. This platform does not provide information storage services.
QQ:1749072012