小鼠生殖工程學技術——10復蘇玻璃化冷凍后的胚胎的步驟
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◆材料
１、 0.25 M 蔗糖２、 KSOM/AA３、 培養皿（Corning 35mm X 10mm Cat.No.430588）４、 藍色槍頭（BM器材 Cat.No.111-R100S）５、 微管６、 自動移液器（GILSON PIPETMAN P-1000）７、 解剖針（夏目制造所 Broach holder Cat.No.E-14）８、 酒精燈（或者臺式微型煤氣燃燒器 Cat.No.RK4102）９、 CO2培養箱（37°C 5% CO2 95% air）
◆步驟
準備清洗胚胎用的培養皿和蔗糖溶液
１. 首先制作清洗復蘇后胚胎的培養皿，靜置在CO2培養箱內30分鐘以上，穩定內部氣體。
２. 預先在CO2培養箱內加熱0.25 M 蔗糖溶液。
胚胎的復蘇
1. 從液氮儲存器內取出凍存的EP管后，立刻打開蓋子，倒掉EP管內的液氮，在室溫下靜置30秒。
2. 用自動移液器把0.9ml已預熱到37°C的0.25 M 蔗糖溶液添加進EP管內，在蔗糖溶液完全溶進凍存液前要迅速移液（10次左右）。
* 融解后的凍存液在常溫下細胞毒性很強，因此需要迅速往EP管內添加0.25 M 蔗糖稀釋凍存液。
移液
１. 如下圖所示，首次移液需迅速把0.9mL 0.25 M 蔗糖溶液轉移至EP管內加熱（請注意如果槍頭的尖端接觸凍存液，槍頭內的蔗糖溶液會凍結并阻塞在槍頭的尖端）。
２. 第二次以后的移液，就按照下圖藍色箭頭所示小幅度移液。
此外，第二次以后的移液，以免損壞胚胎，應小心且迅速有序地移液加熱胚胎。（移液的速度請參考以下視頻）
３. 使用自動給移液器，將凍存液和蔗糖溶液的混合溶液移至培養皿上，接著用0.4~0.5mL的0.25 M 蔗糖溶液清洗EP管。
注意：移液時，盡量避免產生氣泡。在混合溶液移至培養皿上時，如果溶液表面產生氣泡，氣泡會阻礙取回胚胎，此時可用酒精燈加熱解剖針的尖端，然后刺破氣泡。
胚胎復蘇時移液要點：請注意，移液過程中如果槍頭內有氣泡，混合溶液移至在培養皿后，溶液表面產生的大量氣泡會導致難以在顯微鏡下觀察胚胎，無法取回胚胎。
４. 直接從混合溶液里取出胚胎，小心地導入預先制作好（清洗前30分鐘以上開始準備）、清洗胚胎的培養皿上的KSOM/AA滴液里，靜置在培養箱內10分鐘。
靜置10分鐘后
５. 用剩下的KSOM/AA滴液清洗胚胎兩遍。
參考文獻
【1】 Nakao K., Nakagata N., and Katsuki M. 1997. Simple and effcient procedure for cryopreservation of mouse embryos
by simple vitrification. Exp. Anim. 46: 231-234.PDF
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