-SABC(兔IgG)-FITC（POD）?kit-切片與免疫組化-蛋白與免疫
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SABC(兔IgG)- FITC（POD）kit品牌： | 貨號：SA0025| 英文名稱 | SABC(Rabbit IgG)-FITC(POD) Kit |
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產(chǎn)品內(nèi)容：
封閉液（5% BSA） 10ml
Bio-羊抗兔IgG濃縮液 100ul
SABC-FITC濃縮液 100ul
SABC-POD濃縮液 100ul
稀釋液 30ml
20×DAB顯色液A 1ml
20×DAB顯色液B 1ml
抗熒光衰減封片劑 10ml
保存： 如果長時間不使用，請將所有試劑存放于-20℃，如經(jīng)常使用，可將封閉液，稀釋液,20×DAB顯色液B和抗熒光衰減封片劑存放于2-8℃以方便使用。
產(chǎn)品簡介： 本試劑盒適合于一抗為兔IgG來源的免疫組化實驗.DAB及FITC顯色。 SABC是專為免疫組化和其他免疫檢測而設(shè)計的，用以顯示組織和細(xì)胞中抗原分布。鏈霉親和素(StreptAvidin)是一種從鏈霉菌中提取的蛋白質(zhì)，同親和素一樣，對生物素有極高的親和力，親和素是一個堿性蛋白質(zhì)（PI=10），經(jīng)改造后可以轉(zhuǎn)變成中性蛋白質(zhì)。鏈霉親和素等電點接近中性，對組織和細(xì)胞的非特異吸附很低，基于鏈霉親和素的免疫組化方法背景很低。SABC即StreptAvidin—BiotinComplex，SABC大約可形成一百個左右的過氧化物酶或者FITC和五十個左右的鏈霉親和素所構(gòu)成的復(fù)合物。大量的酶與FITC將保證SABC具有很高的敏感性。
操作步驟:（以石蠟切片熱修復(fù)為例）1. 切片常規(guī)脫蠟至水。3%H2O2室溫5-10分鐘以滅活內(nèi)源性酶（如果FITC，可省掉此步）。蒸餾水洗3次。 2. 熱修復(fù)抗原：將切片浸入0.01M 枸櫞酸鹽緩沖液（PH6.0），電爐或微波爐加熱至沸騰后斷電，間隔5-10分鐘后，反復(fù)1-2次。冷卻后PBS（pH7.2-7.6）洗滌1-2次。3. 滴加5%BSA封閉液,室溫20分鐘。甩去多余液體, 免洗。4. 用稀釋液將一抗按一定比例稀釋（稀釋后的一抗4℃可保存一周），也可另行購買抗體稀釋液。滴加稀釋的一抗，37 ℃ 1小時孵育左右或20℃ 2小時左右，也可4℃過夜。PBS（pH7.2-7.4）洗滌3次，每次2分鐘（一抗的稀釋度、孵育時間和溫度與染色強度、背景有直接關(guān)系。一般來說，陽性染色強度不夠時，可提高一抗?jié)舛群脱娱L孵育時間；背景過高時，可降低一抗?jié)舛群涂s短孵育時間）。5. 根據(jù)使用量，用稀釋液將bio-羊抗兔IgG濃縮液按1:100稀釋成工作液(1ml稀釋液加入10ulbio-羊抗兔IgG濃縮液,混勻即成工作液，此工作液4℃可保存一周)。滴加生物素化羊抗兔IgG工作液，20-37℃處理30分鐘。PBS（pH7.2-7.4）洗滌3次，每次2分鐘。如果用熒光觀察，請接步驟6、7，如果用DAB顯色，請直接轉(zhuǎn)至步驟8。6. 根據(jù)使用量,用稀釋液將SABC-FITC濃縮液按1:100稀釋成工作液(1ml稀釋液加入10ulSABC-FITC濃縮液，混勻即成SABC-FITC工作液。此工作液4℃可保存一周).滴加SABC-FITC工作液,20-37℃，30分鐘(避光)。PBS（pH7.2-7.4）洗滌4次，每次5分鐘。7. 滴加抗熒光衰減封片劑封片。熒光顯微鏡觀察。8. 根據(jù)使用量,用稀釋液將SABC-POD濃縮液按1:100稀釋成工作液(1ml稀釋液加入10ulSABC-POD濃縮液，混勻即成SABC-POD工作液。此工作液4℃可保存一周).滴加SABC-POD工作液,20-37℃，30分鐘。PBS（pH7.2-7.4）洗滌4次，每次5分鐘。9.DAB顯色:根據(jù)用量，用PBS（pH7.2-7.4）配制，按1mlPBS加入50ul20×DAB顯色液A，加入50ul 20×DAB顯色液B ，混勻后加至切片。室溫顯色, 鏡下控制反應(yīng)時間，一般在5-30分鐘之間。蒸餾水洗滌終止反應(yīng)。10. 蘇木素輕度復(fù)染。脫水,透明,封片。顯微鏡觀察。
對于細(xì)胞爬片： 常規(guī)固定后，PBS漂洗兩次，再用0.5%TxitonX-100室溫20分鐘，PBS漂洗兩次，3%H2O2（如果用FITC，剛可省掉此步）處理15分鐘；PBS漂洗兩次，下接上面第4步。對于冰凍切片： 固定后，可用PBS漂洗兩次，再接上面第二步。
注意事項： 如果用DAB染色背景過高，在SABC反應(yīng)之后，DAB顯色之前,用加有0.01-0.02%TWEEN-20的PBST（pH7.2-7.4）洗滌切片4次，PBS洗2次，然后DAB顯色。 如果用FITC觀察背景過高，在SABC反應(yīng)之后，用加有0.01—0.02%TWEEN-20的PBST（pH7.2-7.4）洗滌切片4次，PBS洗滌2次，然后封片觀察。 因為免疫組化指標(biāo)眾多，標(biāo)本不一，此步驟僅作參考。
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