EndoFree Plasmid Mega Kit (5)-質粒純化
純化得到至多2.5 mg無內毒素超轉染級純質粒或柯斯質粒DNA
得到的DNA內毒素低于0.1 EU/µg
純化流程快，同時去除內毒素
獲得高產量高拷貝質粒DNA
使用LyseBlue，獲得的裂解和高產量的DNA
EndoFree Plasmid Kit基于陰離子交換技術，可快速制備不含內毒素的質粒DNA。QIAfilter Cartridges通過過濾快速澄清裂解液，DNA產量至多500 μg（Maxi）、2.5 mg（Mega）和10 mg（Giga）。制備的DNA純度超過兩次CsCl梯度離心法所得DNA的純度，非常適合超轉染級純的應用。
質粒純化方法與轉染效率。
使用兩種方法獨立制備pRSVcat，分別使用脂質體介導的方法轉染到COS-7、HeLa和LMH細胞中，及使用磷酸鈣轉染至Huh7細胞中。平均轉染效率以相對于QIAGEN Plasmid Kit制備的DNA的轉染效率表示。
QIAGEN Plasmid Kit procedures.
Neutralized bacterial lysates are incubated directly in the QIAfilter Cartridge and cleared in seconds by filtration. After the endotoxin removal step, the cleared lysate is then loaded onto the anion-exchange tip where plasmid DNA selectively binds under appropriate low-salt and pH conditions. RNA, proteins, metabolites, and other low-molecular-weight impurities are removed by a medium-salt wash, and ultrapure plasmid DNA is eluted in high-salt buffer. The DNA is concentrated and desalted by isopropanol precipitation and collected by centrifugation.
質粒純度與轉染效率。
圖中顯示了在無血清條件下，在懸浮液中生長的CHO SSF3 X9細胞中，質粒DNA的數量和質量對轉染效率的影響。每個點代表三次獨立實驗的平均值；Rel. LU：相對光單位。（數據由瑞士巴塞爾諾華公司的M. Zang-Gandor提供。）
細菌細胞壁。
大腸桿菌細胞壁示意圖。
EndoFree Plasmid Mega Kit (5)-質粒純化
性能
EndoFree Plasmid Mega Kit將高效的內毒素去除步驟整合到質粒純化過程中，不需要額外步驟，也不需用親和柱去除脂多糖。通過QIAfilter Mega-Giga Cartridge過濾細菌裂解液，通過重力流QIAGEN-tip 2500陰離子交換柱純化質粒DNA。從500 ml–2.5 l培養液中至多純化2.5 mg DNA（培養液體積取決于質粒拷貝數量、插入片段大小、宿主菌和培養介質。）純化的DNA無內毒素（<0.1 EU/µg DNA）。
EndoFree Plasmid Kits去除細菌在裂解過程中釋放的內毒素，內毒素會影響原代細胞和敏感培養細胞的DNA轉染。從EndoFree Plasmid Kits得到的無內毒素DNA高度適用于可重復且結果可靠的轉染。QIAGEN超純無內毒素DNA也適用于基因治療研究、基因免疫研究和其他敏感應用。
質粒制備中的內毒素水平*| 質粒準備方法 | 內毒素(EU?/µg DNA) | 平均轉染效率? |
|---|
| EndoFree Plasmid Kit | 0.1 | 154% |
| QIAGEN Plasmid Kit | 9.3 | 100 |
| 2x CsCl | 2.6 | 99% |
| Silica-gel slurry | 1230.0 | 24% |
*宿主菌：大腸桿菌DH5α 質粒： pRSVcat.? 1 ng LPS = 1.8 EU. ? 根據表中數據計算 "Plasmid purification method versus transfection efficiency".
無內毒素DNA配合原代細胞得到高轉染率*| DNA 純化方法 | 轉染細胞百分比 |
|---|
| EndoFree Plasmid Kit | 21.0% ± 0.93 |
| QIAGEN Plasmid Kit | 8.1% ± 0.57 |
| Silica-gel slurry | 5.2% ± 0.74 |
* 原代兔胃壁細胞轉染pEGFP-N2（CLONTECH），pEGFP-N2由所示的方法制備。使用Effectene Transfection Reagent進行轉染。該數據是細胞表達GFP的百分率，由轉染48小時后綠色熒光細胞數量確定。轉染效率是每種純化方法制備的超過2個不同的DNA中6–9個復制樣本的平均值。（數據由C. Chew and J. Parente友情提供，Department of Molecular Medicine and Genetics, Medical College of Georgia, Augusta, Georgia, USA.）
原理
純化的質粒DNA內毒素污染水平取決于所用的純化方法。硅膠技術純化的DNA具有非常高的內毒素水平。QIAGEN、QIAfilter、HiSpeed Plasmid Kits和兩次CsCl超速離心可獲得相對低水平內毒素的純DNA。EndoFree Plasmid Buffer Set包含完整的內毒素去除步驟，獲得<0.1 EU/µg的質粒DNA。
QIAfilter、HiSpeed和EndoFree Plasmid Kits提供的QIAfilter Cartridges是特殊設計的過濾裝置，用于代替細菌細胞堿裂解后的離心步驟。QIAfilter Cartridges可wanquan去除SDS沉淀，清除細菌裂解液，相比離心可大量節約時間，減少1小時的質粒純化時間。QIAfilter Mega-Giga Cartridges采用內部真空的方式輕松的澄清大量的細菌裂解物。
QIAGEN-tips中dute的陰離子交換樹脂（不提供EndoFree Plasmid Buffer Set）專為核酸純化而開發。它的分離性能使得DNA純度與連續兩次CsCl梯度離心獲得的DNA純度相當。由重力流驅動并持續運轉的預裝QIAGEN-tips，限度減少手動制備質粒所需的時間。整個QIAGEN質粒純化系統不使用有毒物質，如benfen，氯仿，溴化乙錠和CsCl，限度地減少對用戶和環境的危害。
內毒素，又稱脂多糖或LPS，是革蘭氏陰性菌細胞膜的組成部分，如大腸桿菌。內毒素在質粒解裂純化過程中釋放，并顯著地降低內毒素敏感的細胞株轉染效率。此外，內毒素與DNA競爭“自由"轉染試劑，影響轉染實驗。內毒素也誘導巨噬細胞和B細胞等免疫細胞中非特異性免疫反應，從而導致轉染結果的誤讀。這些反應包括誘導的蛋白質和脂類，如IL -1和前列腺素的合成。總體而言，內毒素在轉染實驗中是不可控變量，影響結果的可重復性，使它們難以對比、解讀。在基因治療研究中，內毒素可造成內毒素休克綜合癥和激活補體級聯，干擾研究。
操作流程
在堿性條件下，細菌細胞裂解，用QIAfilter Mega-Giga Cartridge清除粗裂解物。將Endotoxin Removal Buffer加入到過濾后的裂解液中。冰浴后，將純凈的裂解物上樣到陰離子交換柱上，在適當的低鹽和pH條件下，質粒DNA選擇性結合。用中鹽緩沖液清除RNA、蛋白質、代謝產物和其他低分子量雜質，超純質粒DNA被高鹽緩沖液洗脫。DNA由異丙醇脫鹽、沉淀并且離心回收。
應用
使用EndoFree Plasmid Kits純化的DNA適合多種敏感應用，包括：
轉染，包括原代、敏感和懸浮細胞
基因治療研究
基因沉默
顯微注射
| 特點 | 參數 |
| Applications | Transfection, gene therapy |
| Culture volume/starting material | 500 ml – 2.5 liters culture volume |
| Plasmid type | High-copy, low-copy, cosmid DNA |
| Processing | Manual (vacuum and centrifugation) |
| Samples per run; throughput | 1 sample per run |
| Technology | Anion-exchange technology |
| Time per run or prep per run | 220 min |
| Yield | |
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